7.8 벤조피렌
7.8.1 식용유지 중 벤조피렌
가. 제1법
1) 시험법 적용범위
식용유지에 적용한다.
2) 분석원리
식용유지 중 벤조피렌을 내부표준물질로 3-메틸콜란트렌을 사용하여 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)과 헥산으로 추출한 후 고체상 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.
3) 장치
가) 액체크로마토그래프/형광검출기 (HPLC/FLD)를 사용한다.
(4) 시약 및 시액
가) 용매：잔류농약시험용 또는 이와 동등한 것
나) 물：3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 후로리실 카트리지：SPE용 또는 이와 동등한 것
라) 멤브레인 필터：수용성 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 이와 동등한 것
마) 표준원액：벤조피렌 표준품을 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.
바) 내부표준원액：3-메틸콜란트렌 표준품을 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.
사) 표준용액：표준원액을 아세토니트릴을 사용하여 적당한 농도로 희석한다.
아) 내부표준용액：내부표준원액을 아세토니트릴을 사용하여 적당한 농도로 희석한다.
자) 기타시약：잔류농약시험용 또는 특급
5) 시험용액의 조제
가) 추출
검체 10 g을 정밀히 달아 내부표준용액 1 mL를 첨가하고 헥산 100 mL에 녹여 분액깔때기 (Ⅰ)에 옮기고 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1) 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층을 분리하여 다른 분액깔때기 (Ⅱ)에 옮긴다. 헥산층에 N,N-디메틸포름아마이드-물 25 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층을 분액깔때기 (Ⅱ)에 합친다. 여기에 1% 황산나트륨 용액 100 mL를 넣어 섞고 헥산 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 헥산층을 분액깔때기 (Ⅲ)에 옮긴다. N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층에 헥산 35 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 헥산층을 위의 분액깔때기 (Ⅲ)에 합친다. 물 40 mL씩을 넣고 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 물층은 버리는 조작을 2회 되풀이한다. 헥산층을 무수황산나트륨 약 15 g을 넣은 여과지를 사용하여 탈수여과한 후 40 ℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 약 2 mL로 농축한다.
주1) 액액추출 시 층분리가 명확히 확인될 때까지 충분한 방치시간을 유지해야 한다.
나) 정제
후로리실카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2～3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 카트리지에 위의 농축액을 1 mL/분의 속도로 가한다. 이어서 헥산 5 mL와 헥산/디클로로메탄 (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40 ℃ 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 아세토니트릴에 녹여 전량을 1 mL로 하고 이를 0.5 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
(1) 칼럼：Supelcosil LC-PAH(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 칼럼온도 : 35℃
(3) 이동상 : 아세토니트릴과 물의 혼합액 (8:2)
(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min
(5) 검출기파장 : 여기파장 294㎚, 형광파장 404㎚
나) 검량선의 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크높이 또는 피이크면적을 구하여 검량선을 작성한다.
다) 표준품의 크로마토그램
그림 1. 표준품(벤조피렌: BaP)과 내부표준품(3-메틸콜란트렌: ISTD) 크로마토그램
라) 정량한계 : 0.9 μg/kg
7) 정성시험
위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.
8) 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피이크높이법 또는 피이크면적법에 따라 정량한다.
가) 계산방법
검량곡선에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 피크에 대한 면적비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 면적비 [ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 계산한다.
AS：검량곡선 표준용액의 표준물질 피크면적
AIS：검량곡선 표준용액의 내부표준물질 피크면적
ASAM：시험용액의 벤조피렌 피크면적
ASAMIS：시험용액의 내부표준물질 피크면적
나. 제2법
1) 시험법 적용범위
식용유지에 적용한다.
2) 분석원리
식용유지 중 벤조피렌을 내부표준물질로 벤조피렌-d12을 사용하여 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)과 헥산으로 추출한 후 고체상 카트리지로 정제하여 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)를 사용한다.
4) 시약 및 시액
가) 용매 : 잔류농약시험용 또는 이와 동등한 것
나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 실리카 카트리지 : SPE용 또는 이와 동등한 것
라) 멤브레인 필터 : 수용성 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 이와 동등한 것
마) 표준원액 : 벤조피렌 표준품을 디클로로메탄에 녹여 100 ㎍/mL로 한다.
바) 내부표준원액 : 벤조피렌-d12 표준품을 디클로로메탄에 녹여 100 ㎍/mL로 한다.
사) 표준용액 : 표준원액을 디클로로메탄을 사용하여 적당한 농도로 희석한다.
아) 내부표준용액 : 내부표준원액을 디클로로메탄을 사용하여 적당한 농도로 희석한다.
자) 기타시약 : 잔류농약시험용 또는 특급
5) 시험용액의 조제
가) 추출
균질화 된 검체 약 10 g을 달아 내부표준용액을 첨가하고 헥산 100 mL에 녹여 분액깔대기 (Ⅰ)에 옮기고 N,N-디메틸포름 아마이드-물 (9:1) 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층을 분리하여 다른 분액깔대기 (Ⅱ)에 옮긴다. 헥산층에 N,N-디메틸포름아마이드-물 25 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1) 층을 분액깔대기 (Ⅱ)에 합친다. 여기에 1% 황산나트륨 용액 100 mL를 넣어 섞고 헥산 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 헥산층을 분액깔대기 (Ⅲ)에 옮긴다.
N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층에 헥산 35 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 헥산층을 위의 분액깔대기 (Ⅲ)에 합친다. 물 50 mL씩을 넣고 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 물층은 버리는 조작을 2회 되풀이한다. 헥산층을 무수황산나트륨 약 15 g을 넣은 여과지를 사용하여 탈수여과한 후 40 ℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 약 2 mL로 농축한다.
주1) 액액추출 시 층분리가 명확히 확인될 때까지 충분한 방치시간을 유지해야 한다.
나) 정제
실리카 카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2～3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 카트리지에 위의 농축액을 넣고 헥산 5 mL와 헥산/디클로로메탄 (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 디클로로메탄에 녹여 전량을 200 μL로 하고 이를 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 기체크로마토그래프의 측정조건
(1) 칼럼 : HP-5MS(30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)또는 이와 동등한 것
(2) 주입부 온도 : 320℃
(3) 오븐온도 : 초기 온도 100℃에서 10분간 유지하고 60℃/분의 비율로 280℃까지 온도를 상승시켜 10분간 유지한다(post run : 310℃, 10분).
(4) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (1.5 mL/분)
(5) 주입방법 : splitless
(6) 주입량 : 1 µL
※ 주입부 및 오븐온도는 사용장비에 따라 적절히 조정가능
나) 질량분석기 측정조건
(1) 이온화 방법 : EI 모드 (70eV)
(2) SIM mode
다) 검량선의 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프/질량분석기에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크높이 또는 피이크면적을 구하여 검량선을 작성한다.
라) 표준품의 크로마토그램
B(a)P
B(a)P-d12
그림 1. 표준품(벤조피렌: B(a)P)과 내부표준품(벤조피렌-d12: B(a)P-d12)의 크로마토그램.
7) 정성시험
위 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 위 표와 같이 확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 250, 253 이온에 대한 각 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다.
8) 정량시험
검량곡선에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 피크에 대한 면적비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 피크 면적비 [ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 계산한다.
AS : 검량곡선표준용액의 표준물질 피크면적
AIS : 검량곡선표준용액의 내부표준물질 피크면적
ASAM : 시험용액의 벤조피렌 피크면적
ASAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적
7.8 Benzo(a)pyrene(BaP)
7.8.1 Benzo(a)pyrene in edible oil
A. Test method 1
1) Scope of the Test method
Apply to edible oil
2) Principle of the analysis
After extracting Benzopyrene in edible oils by N, N-dimethylformamide-water(9:1) and nucleic acid with 3-methylcholanthrene as an internal standard material, and analyze it from refined solid state cartridge by liquid chromatograph/fluorometric detector
3) Apparatus
A) Use liquid chromatograph/fluorometric detector(HPLC/FLD).
4) Reagents and Solution
a) Solvent：for testing remained pesticide or equivalent
b) Water : third distilled or equivalent
c) Florisil cartridge：for SPE or equivalent
d) Membrane filter：water soluble polytetrafluoroethylene or equivalent
e) Standard undiluted solution：make 100 μg/mL standard BaP after dissolving in acetonitrile.
f) Internal standard solution：make 100 μg/mL standard 3-methylcholanthrene after dissolving in acetonitrile.
g) Standard solution：Dilute standard solution with acetonitrile to make proper concentration.
h) Internal standard solution: Dilute internal standard solution with acetonitrile to proper concentration.
i) The other reagents：For remained pesticide test or special.
5) Preparation of solution for the test
A) Extraction
Add 1ml internal standard solution at accurately weighted specimen 10g, and move melted hexane 100ml at a separating funnel(I). Shake well after putting N,N-dimethylformamide(9:1)-water 50ml to fully separate layers. Then, move N,N-dimethylformamide(9:1) layer to another separating funnel(II). Put N,N-dimethylformamide(9:1)-water 50ml at the hexane layer, and repeat above procedure two times. Combine N,N-dimethylformamide(9:1)-water layer to the separating funnel(II). Then, shake well after mixing 1% sodium sulfate solution 100ml and hexane 50ml, and stay to fully separate layers. Move a hexane layer to separate funnel(III). Put hexane 35ml at the N,N-dimethylformamide(9:1)-water layer, and repeat above two times, then, combine the hexane layer to above separating funnel(III). Throw away water layer after shaking and stay well with 40ml water to fully separate layers, and repeat this procedure two times. After dewatering filteration for hexane layer through the filer containing sodium sulfate anhydrous 15g, concentrate it as 2ml with decompression in below 40℃ water bath.
Not1) Stay and leave for long enough time to separate the layers certainly and fully when extract the liquid.
B) Refinement
Use the florisil cartridge after exposing it at dichloromethane 10ml and hexane 20ml at 2~3 drops per second. To the top of this cartridge, applying above extracted liquid at the speed of 1ml/minute. And subsequently after eluted by hexane 5ml and hexane/dichloromethane(3:1) 15ml respectively, blow those eluted solution at less than 40℃ water bath under nitrogen gas. The remained residues in acetonitrile to make total amount as 1ml, and filter it by 0.5μm membrane filter to make the test solution.
C) Test procedure
a) measurement condition of liquid chromatograph
(1) column：Supelcosil LC-PAH(4.6 × 250 mm, 5 μm) or equivalent
(2) column temperature : 35℃
(3) moving phase : mixed solution of acetonitrile and water(8:2)
(4) moving flux : 1.0 mL/min
(5) detector wavelength : excitation wavelength 294㎚, fluorescence wavelength 404㎚
b) Prepare a calibration curve
Take the standard solution at each different concentration level, and inject to liquid chromatograph respectively. Measure each gained peak height and peak area of chromatograph to prepare a calibration curve.
c) Chromatograph of standard preparation
(분)
Figure 1. standard prepartion(benzopyrene: BaP) and internal standard preparation(3-methylcholanthrene: ISTD) chromatograph
d) limit of standard : 0.9 μg/kg
7) Qualitative test
The peak in chromatograph gained in above condition has to be correspond with the retention time of the peak of the standard solution under the same measurement condition.
8) Quantitative test
Measure the test result obtained via same conditions of the qualitative test based on the peak height and peak area methods.
a) Calculation
Set the standard material obtained from the calibration-curve and the area ratio[AS/AIS] of the peak of internal standard material as Y-axis, and set the concentration of standard material as X axis to prepare the calibration-curve. And substitute the area ratio[ASAM/ASAMIS] of the test solution for Y axis to calculate the concentration of benzopyrene.
AS：standard material’s peak area of the standard solution of calibration-curve
AIS：internal standard material’s peak area of the standard solution of calibration-curve
ASAM：benzopyrene’s peak area of the test solution
ASAMIS：peak area of the internanl standard material of the test solution
B. Test method 2
1) Scope of the Test method
Apply to edible oil
2) Principle of the analysis
After extracting benzopyrene-d12 in edible oils by N, N-dimethylformamide-water(9:1) and nucleic acid with 3-methylcholanthrene as an internal standard material, and analyze it from refined solid state cartridge by liquid chromatograph/fluorometric detector
3) Apparatus
A) Use gas chromatograph/mass spectrometer(GC/MS).
4) Reagents and Solution
a) Solvent：for testing remained pesticide or equivalent
b) Water : third distilled or equivalent
c) Silica cartridge：for SPE or equivalent
d) Membrane filter：water soluble polytetrafluoroethylene or equivalent
e) Standard undiluted solution：make 100 μg/mL standard benzopyrene preparation after dissolving in dichloromethane.
f) Internal standard solution：make 100 μg/mL standard benzopyrene-d12 preparation after dissolving in dichloromethane.
g) Standard solution：Dilute standard solution with dichloromethane to make proper concentration.
h) Internal standard solution: Dilute internal standard solution with dichloromethane to proper concentration.
i) The other reagents：For remained pesticide test or special.
5) Preparation of solution for the test
A) Extraction
Add 1ml internal standard solution at homogenized specimen 10g, and move melted hexane 100ml at a separating funnel(I). Shake well after putting N,N-dimethylformamide(9:1)-water 50ml to fully separate layers. Then, move N,N-dimethylformamide(9:1) layer to another separating funnel(II). Put N,N-dimethylformamide(9:1)-water 50ml at the hexane layer, and repeat above procedure two times. Combine N,N-dimethylformamide(9:1)-water layer to the separating funnel(II). Then, shake well after mixing 1% sodium sulfate solution 100ml and hexane 50ml, and stay to fully separate layers. Move a hexane layer to separate funnel(III). Put hexane 35ml at the N,N-dimethylformamide(9:1)-water layer, and repeat above two times, then, combine the hexane layer to above separating funnel(III). Throw away water layer after shaking and stay well with 540ml water to fully separate layers, and repeat this procedure two times. After dewatering filteration for hexane layer through the filer containing sodium sulfate anhydrous 15g, concentrate it as 2ml with decompression in below 40℃ water bath.
Not1) Stay and leave for long enough time to separate the layers certainly and fully when extract the liquid.
B) Refinement
Use the silica cartridge after exposing it at dichloromethane 10ml and hexane 20ml at 2~3 drops per second. To the top of this cartridge, applying the concentrated liquid, and subsequently after eluted by hexane 5ml and hexane/dichloromethane(3:1) 15ml respectively, blow those eluted solution at less than 40℃ water bath under nitrogen gas. The remained residues in dichloromethane to make total amount as 200 μL, and filter it by 0.45μm membrane filter to make the test solution.
6) Test prodedure
a) measurement condition of gas chromatograph
(1) column : HP-5MS(30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) or equivalent
(2) temperature of injection part : 320℃
(3) oven temperature : maintain for 10 minutes at early temperature 100℃, and maintain for 10 minutes after increasing temperature up to 280℃ at the ratio of 60℃/minute(post run : 310℃, 10minutes).
(4) carrier gas and flux : hellium (1.5 mL/minute)
(5) injection method : splitless
(6) injection amount : 1 µL
※ injection part and oven temperature could be adjustable for equipments to use.
b) mass spectrometer measurement condition
(1) ionization method : EI mode (70eV)
(2) SIM mode
b) Prepare a calibration curve
Take the standard solution at each different concentration level, and inject to gas chromatograph/mass spectrometer respectively. Measure each gained peak height and peak area of chromatograph to prepare a calibration curve.
c) Chromatograph of standard preparation
Figure 1. standard prepartion(benzopyrene: B(a)P) and internal standard preparation(benzopyrene-d12: B(a)P-d12) chromatograph
7) Qualitative test
The peak in test solution chromatograph gained in above condition has to checked whether the peak is corresponded with the retention time of the peak of the standard. The ion of test solution has to be identified, and by comparing the response strength ratio(m/z 250, 253 the percentage of each ion toward ion, response ratio) between the ion of standard solution and the ion of test solution, the ration has to be same within ± 10% ratio.
8) Quantitative test
Set the standard material obtained from the calibration-curve and the area ratio[AS/AIS] of the peak of internal standard material as Y-axis, and set the concentration of standard material as X axis to prepare the calibration-curve. And substitute the area ratio[ASAM/ASAMIS] of the test solution for Y axis to calculate the concentration of benzopyrene.
AS：standard material’s peak area of the standard solution of calibration-curve
AIS：internal standard material’s peak area of the standard solution of calibration-curve
ASAM：benzopyrene’s peak area of the test solution
ASAMIS：peak area of the internanl standard material of the test solution
7.8.1 식용유지 중 벤조피렌
가. 제1법
1) 시험법 적용범위
식용유지에 적용한다.
2) 분석원리
식용유지 중 벤조피렌을 내부표준물질로 3-메틸콜란트렌을 사용하여 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)과 헥산으로 추출한 후 고체상 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.
3) 장치
가) 액체크로마토그래프/형광검출기 (HPLC/FLD)를 사용한다.
(4) 시약 및 시액
가) 용매：잔류농약시험용 또는 이와 동등한 것
나) 물：3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 후로리실 카트리지：SPE용 또는 이와 동등한 것
라) 멤브레인 필터：수용성 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 이와 동등한 것
마) 표준원액：벤조피렌 표준품을 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.
바) 내부표준원액：3-메틸콜란트렌 표준품을 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.
사) 표준용액：표준원액을 아세토니트릴을 사용하여 적당한 농도로 희석한다.
아) 내부표준용액：내부표준원액을 아세토니트릴을 사용하여 적당한 농도로 희석한다.
자) 기타시약：잔류농약시험용 또는 특급
5) 시험용액의 조제
가) 추출
검체 10 g을 정밀히 달아 내부표준용액 1 mL를 첨가하고 헥산 100 mL에 녹여 분액깔때기 (Ⅰ)에 옮기고 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1) 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층을 분리하여 다른 분액깔때기 (Ⅱ)에 옮긴다. 헥산층에 N,N-디메틸포름아마이드-물 25 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층을 분액깔때기 (Ⅱ)에 합친다. 여기에 1% 황산나트륨 용액 100 mL를 넣어 섞고 헥산 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 헥산층을 분액깔때기 (Ⅲ)에 옮긴다. N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층에 헥산 35 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 헥산층을 위의 분액깔때기 (Ⅲ)에 합친다. 물 40 mL씩을 넣고 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 물층은 버리는 조작을 2회 되풀이한다. 헥산층을 무수황산나트륨 약 15 g을 넣은 여과지를 사용하여 탈수여과한 후 40 ℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 약 2 mL로 농축한다.
주1) 액액추출 시 층분리가 명확히 확인될 때까지 충분한 방치시간을 유지해야 한다.
나) 정제
후로리실카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2～3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 카트리지에 위의 농축액을 1 mL/분의 속도로 가한다. 이어서 헥산 5 mL와 헥산/디클로로메탄 (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40 ℃ 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 아세토니트릴에 녹여 전량을 1 mL로 하고 이를 0.5 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
(1) 칼럼：Supelcosil LC-PAH(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 칼럼온도 : 35℃
(3) 이동상 : 아세토니트릴과 물의 혼합액 (8:2)
(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min
(5) 검출기파장 : 여기파장 294㎚, 형광파장 404㎚
나) 검량선의 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크높이 또는 피이크면적을 구하여 검량선을 작성한다.
다) 표준품의 크로마토그램
그림 1. 표준품(벤조피렌: BaP)과 내부표준품(3-메틸콜란트렌: ISTD) 크로마토그램
라) 정량한계 : 0.9 μg/kg
7) 정성시험
위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.
8) 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피이크높이법 또는 피이크면적법에 따라 정량한다.
가) 계산방법
검량곡선에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 피크에 대한 면적비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 면적비 [ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 계산한다.
AS：검량곡선 표준용액의 표준물질 피크면적
AIS：검량곡선 표준용액의 내부표준물질 피크면적
ASAM：시험용액의 벤조피렌 피크면적
ASAMIS：시험용액의 내부표준물질 피크면적
나. 제2법
1) 시험법 적용범위
식용유지에 적용한다.
2) 분석원리
식용유지 중 벤조피렌을 내부표준물질로 벤조피렌-d12을 사용하여 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)과 헥산으로 추출한 후 고체상 카트리지로 정제하여 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)를 사용한다.
4) 시약 및 시액
가) 용매 : 잔류농약시험용 또는 이와 동등한 것
나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 실리카 카트리지 : SPE용 또는 이와 동등한 것
라) 멤브레인 필터 : 수용성 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 이와 동등한 것
마) 표준원액 : 벤조피렌 표준품을 디클로로메탄에 녹여 100 ㎍/mL로 한다.
바) 내부표준원액 : 벤조피렌-d12 표준품을 디클로로메탄에 녹여 100 ㎍/mL로 한다.
사) 표준용액 : 표준원액을 디클로로메탄을 사용하여 적당한 농도로 희석한다.
아) 내부표준용액 : 내부표준원액을 디클로로메탄을 사용하여 적당한 농도로 희석한다.
자) 기타시약 : 잔류농약시험용 또는 특급
5) 시험용액의 조제
가) 추출
균질화 된 검체 약 10 g을 달아 내부표준용액을 첨가하고 헥산 100 mL에 녹여 분액깔대기 (Ⅰ)에 옮기고 N,N-디메틸포름 아마이드-물 (9:1) 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층을 분리하여 다른 분액깔대기 (Ⅱ)에 옮긴다. 헥산층에 N,N-디메틸포름아마이드-물 25 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1) 층을 분액깔대기 (Ⅱ)에 합친다. 여기에 1% 황산나트륨 용액 100 mL를 넣어 섞고 헥산 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 헥산층을 분액깔대기 (Ⅲ)에 옮긴다.
N,N-디메틸포름아마이드-물 (9:1)층에 헥산 35 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 헥산층을 위의 분액깔대기 (Ⅲ)에 합친다. 물 50 mL씩을 넣고 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 충분히 분리시킨 후 물층은 버리는 조작을 2회 되풀이한다. 헥산층을 무수황산나트륨 약 15 g을 넣은 여과지를 사용하여 탈수여과한 후 40 ℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 약 2 mL로 농축한다.
주1) 액액추출 시 층분리가 명확히 확인될 때까지 충분한 방치시간을 유지해야 한다.
나) 정제
실리카 카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2～3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 카트리지에 위의 농축액을 넣고 헥산 5 mL와 헥산/디클로로메탄 (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 디클로로메탄에 녹여 전량을 200 μL로 하고 이를 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 기체크로마토그래프의 측정조건
(1) 칼럼 : HP-5MS(30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)또는 이와 동등한 것
(2) 주입부 온도 : 320℃
(3) 오븐온도 : 초기 온도 100℃에서 10분간 유지하고 60℃/분의 비율로 280℃까지 온도를 상승시켜 10분간 유지한다(post run : 310℃, 10분).
(4) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (1.5 mL/분)
(5) 주입방법 : splitless
(6) 주입량 : 1 µL
※ 주입부 및 오븐온도는 사용장비에 따라 적절히 조정가능
나) 질량분석기 측정조건
(1) 이온화 방법 : EI 모드 (70eV)
(2) SIM mode
다) 검량선의 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프/질량분석기에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크높이 또는 피이크면적을 구하여 검량선을 작성한다.
라) 표준품의 크로마토그램
B(a)P
B(a)P-d12
그림 1. 표준품(벤조피렌: B(a)P)과 내부표준품(벤조피렌-d12: B(a)P-d12)의 크로마토그램.
7) 정성시험
위 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 위 표와 같이 확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 250, 253 이온에 대한 각 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다.
8) 정량시험
검량곡선에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 피크에 대한 면적비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 피크 면적비 [ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 계산한다.
AS : 검량곡선표준용액의 표준물질 피크면적
AIS : 검량곡선표준용액의 내부표준물질 피크면적
ASAM : 시험용액의 벤조피렌 피크면적
ASAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적
7.8 Benzo(a)pyrene(BaP)
7.8.1 Benzo(a)pyrene in edible oil
A. Test method 1
1) Scope of the Test method
Apply to edible oil
2) Principle of the analysis
After extracting Benzopyrene in edible oils by N, N-dimethylformamide-water(9:1) and nucleic acid with 3-methylcholanthrene as an internal standard material, and analyze it from refined solid state cartridge by liquid chromatograph/fluorometric detector
3) Apparatus
A) Use liquid chromatograph/fluorometric detector(HPLC/FLD).
4) Reagents and Solution
a) Solvent：for testing remained pesticide or equivalent
b) Water : third distilled or equivalent
c) Florisil cartridge：for SPE or equivalent
d) Membrane filter：water soluble polytetrafluoroethylene or equivalent
e) Standard undiluted solution：make 100 μg/mL standard BaP after dissolving in acetonitrile.
f) Internal standard solution：make 100 μg/mL standard 3-methylcholanthrene after dissolving in acetonitrile.
g) Standard solution：Dilute standard solution with acetonitrile to make proper concentration.
h) Internal standard solution: Dilute internal standard solution with acetonitrile to proper concentration.
i) The other reagents：For remained pesticide test or special.
5) Preparation of solution for the test
A) Extraction
Add 1ml internal standard solution at accurately weighted specimen 10g, and move melted hexane 100ml at a separating funnel(I). Shake well after putting N,N-dimethylformamide(9:1)-water 50ml to fully separate layers. Then, move N,N-dimethylformamide(9:1) layer to another separating funnel(II). Put N,N-dimethylformamide(9:1)-water 50ml at the hexane layer, and repeat above procedure two times. Combine N,N-dimethylformamide(9:1)-water layer to the separating funnel(II). Then, shake well after mixing 1% sodium sulfate solution 100ml and hexane 50ml, and stay to fully separate layers. Move a hexane layer to separate funnel(III). Put hexane 35ml at the N,N-dimethylformamide(9:1)-water layer, and repeat above two times, then, combine the hexane layer to above separating funnel(III). Throw away water layer after shaking and stay well with 40ml water to fully separate layers, and repeat this procedure two times. After dewatering filteration for hexane layer through the filer containing sodium sulfate anhydrous 15g, concentrate it as 2ml with decompression in below 40℃ water bath.
Not1) Stay and leave for long enough time to separate the layers certainly and fully when extract the liquid.
B) Refinement
Use the florisil cartridge after exposing it at dichloromethane 10ml and hexane 20ml at 2~3 drops per second. To the top of this cartridge, applying above extracted liquid at the speed of 1ml/minute. And subsequently after eluted by hexane 5ml and hexane/dichloromethane(3:1) 15ml respectively, blow those eluted solution at less than 40℃ water bath under nitrogen gas. The remained residues in acetonitrile to make total amount as 1ml, and filter it by 0.5μm membrane filter to make the test solution.
C) Test procedure
a) measurement condition of liquid chromatograph
(1) column：Supelcosil LC-PAH(4.6 × 250 mm, 5 μm) or equivalent
(2) column temperature : 35℃
(3) moving phase : mixed solution of acetonitrile and water(8:2)
(4) moving flux : 1.0 mL/min
(5) detector wavelength : excitation wavelength 294㎚, fluorescence wavelength 404㎚
b) Prepare a calibration curve
Take the standard solution at each different concentration level, and inject to liquid chromatograph respectively. Measure each gained peak height and peak area of chromatograph to prepare a calibration curve.
c) Chromatograph of standard preparation
(분)
Figure 1. standard prepartion(benzopyrene: BaP) and internal standard preparation(3-methylcholanthrene: ISTD) chromatograph
d) limit of standard : 0.9 μg/kg
7) Qualitative test
The peak in chromatograph gained in above condition has to be correspond with the retention time of the peak of the standard solution under the same measurement condition.
8) Quantitative test
Measure the test result obtained via same conditions of the qualitative test based on the peak height and peak area methods.
a) Calculation
Set the standard material obtained from the calibration-curve and the area ratio[AS/AIS] of the peak of internal standard material as Y-axis, and set the concentration of standard material as X axis to prepare the calibration-curve. And substitute the area ratio[ASAM/ASAMIS] of the test solution for Y axis to calculate the concentration of benzopyrene.
AS：standard material’s peak area of the standard solution of calibration-curve
AIS：internal standard material’s peak area of the standard solution of calibration-curve
ASAM：benzopyrene’s peak area of the test solution
ASAMIS：peak area of the internanl standard material of the test solution
B. Test method 2
1) Scope of the Test method
Apply to edible oil
2) Principle of the analysis
After extracting benzopyrene-d12 in edible oils by N, N-dimethylformamide-water(9:1) and nucleic acid with 3-methylcholanthrene as an internal standard material, and analyze it from refined solid state cartridge by liquid chromatograph/fluorometric detector
3) Apparatus
A) Use gas chromatograph/mass spectrometer(GC/MS).
4) Reagents and Solution
a) Solvent：for testing remained pesticide or equivalent
b) Water : third distilled or equivalent
c) Silica cartridge：for SPE or equivalent
d) Membrane filter：water soluble polytetrafluoroethylene or equivalent
e) Standard undiluted solution：make 100 μg/mL standard benzopyrene preparation after dissolving in dichloromethane.
f) Internal standard solution：make 100 μg/mL standard benzopyrene-d12 preparation after dissolving in dichloromethane.
g) Standard solution：Dilute standard solution with dichloromethane to make proper concentration.
h) Internal standard solution: Dilute internal standard solution with dichloromethane to proper concentration.
i) The other reagents：For remained pesticide test or special.
5) Preparation of solution for the test
A) Extraction
Add 1ml internal standard solution at homogenized specimen 10g, and move melted hexane 100ml at a separating funnel(I). Shake well after putting N,N-dimethylformamide(9:1)-water 50ml to fully separate layers. Then, move N,N-dimethylformamide(9:1) layer to another separating funnel(II). Put N,N-dimethylformamide(9:1)-water 50ml at the hexane layer, and repeat above procedure two times. Combine N,N-dimethylformamide(9:1)-water layer to the separating funnel(II). Then, shake well after mixing 1% sodium sulfate solution 100ml and hexane 50ml, and stay to fully separate layers. Move a hexane layer to separate funnel(III). Put hexane 35ml at the N,N-dimethylformamide(9:1)-water layer, and repeat above two times, then, combine the hexane layer to above separating funnel(III). Throw away water layer after shaking and stay well with 540ml water to fully separate layers, and repeat this procedure two times. After dewatering filteration for hexane layer through the filer containing sodium sulfate anhydrous 15g, concentrate it as 2ml with decompression in below 40℃ water bath.
Not1) Stay and leave for long enough time to separate the layers certainly and fully when extract the liquid.
B) Refinement
Use the silica cartridge after exposing it at dichloromethane 10ml and hexane 20ml at 2~3 drops per second. To the top of this cartridge, applying the concentrated liquid, and subsequently after eluted by hexane 5ml and hexane/dichloromethane(3:1) 15ml respectively, blow those eluted solution at less than 40℃ water bath under nitrogen gas. The remained residues in dichloromethane to make total amount as 200 μL, and filter it by 0.45μm membrane filter to make the test solution.
6) Test prodedure
a) measurement condition of gas chromatograph
(1) column : HP-5MS(30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) or equivalent
(2) temperature of injection part : 320℃
(3) oven temperature : maintain for 10 minutes at early temperature 100℃, and maintain for 10 minutes after increasing temperature up to 280℃ at the ratio of 60℃/minute(post run : 310℃, 10minutes).
(4) carrier gas and flux : hellium (1.5 mL/minute)
(5) injection method : splitless
(6) injection amount : 1 µL
※ injection part and oven temperature could be adjustable for equipments to use.
b) mass spectrometer measurement condition
(1) ionization method : EI mode (70eV)
(2) SIM mode
b) Prepare a calibration curve
Take the standard solution at each different concentration level, and inject to gas chromatograph/mass spectrometer respectively. Measure each gained peak height and peak area of chromatograph to prepare a calibration curve.
c) Chromatograph of standard preparation
Figure 1. standard prepartion(benzopyrene: B(a)P) and internal standard preparation(benzopyrene-d12: B(a)P-d12) chromatograph
7) Qualitative test
The peak in test solution chromatograph gained in above condition has to checked whether the peak is corresponded with the retention time of the peak of the standard. The ion of test solution has to be identified, and by comparing the response strength ratio(m/z 250, 253 the percentage of each ion toward ion, response ratio) between the ion of standard solution and the ion of test solution, the ration has to be same within ± 10% ratio.
8) Quantitative test
Set the standard material obtained from the calibration-curve and the area ratio[AS/AIS] of the peak of internal standard material as Y-axis, and set the concentration of standard material as X axis to prepare the calibration-curve. And substitute the area ratio[ASAM/ASAMIS] of the test solution for Y axis to calculate the concentration of benzopyrene.
AS：standard material’s peak area of the standard solution of calibration-curve
AIS：internal standard material’s peak area of the standard solution of calibration-curve
ASAM：benzopyrene’s peak area of the test solution
ASAMIS：peak area of the internanl standard material of the test solution
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